De Dierenbescherming komt op voor de belangen van alle dieren, waaronder huisdieren, landbouwdieren, dieren in het wild en proefdieren. Zij gaan daarbij uit van twee grondbeginselen. De eerste stelt dat dieren een eigen intrinsieke waarde hebben. Het dier moet worden behandeld als een zelfstandig wezen met gevoelens en bewustzijn, en dient daarom met respect te worden behandeld. De tweede stelt dat de mens de plicht heeft om dieren goed te behandelen en te beschermen.

Centraal staat van oudsher het welzijn van gezelschaps- en gebruiksdieren. Landbouwdieren krijgen veelvuldig aandacht, vanwege de misstanden in de bio-industrie. In 2007 lanceerde de Dierenbescherming het Beter Leven keurmerk voor vlees, kip en eieren. Het kenmerk helpt consumenten bij het maken van een diervriendelijke keuze, door middel van een drie-sterrensysteem. Per 2014 hebben zo’n 30 miljoen kippen, koeien en varkens een diervriendelijker leven gehad dankzij het kenmerk.

Wilde dieren vormen ook een belangrijk thema voor de Dierenbescherming. Uitgangspunt is dat de mens zo min mogelijk ingrijpt in de natuur. De organisatie strijdt tegen de plezierjacht en reikt zoveel mogelijk diervriendelijke alternatieven aan in het kader van bestrijding van schade aan gewassen en populatiebeheer.

Ten slotte krijgen proefdieren de nodige belangstelling. Geprobeerd wordt het aantal proefdieren terug te brengen en nauwkeuriger en in grotere openbaarheid te toetsen wanneer dergelijke proeven zinvol zijn.

De vereniging heeft een achterban van zo’n 180.000 mensen en dagelijks zijn er duizenden vrijwilligers actief. De Dierenbescherming heeft tevens een eigen jeugdclub, Kids for Animals. Naast voorlichting (onder andere cursussen voor hondeneigenaren en dieren-EHBO) en praktische activiteiten (waaronder de inspectiedienst, asiels en dierenambulances) behoren ook lobby-activiteiten en acties tot het werk van de Dierenbescherming. Mede dankzij de Dierenbescherming is de wetgeving voor onder andere landbouwhuisdieren en proefdieren sterk verbeterd.

De Dierenbescherming werkt nauw samen met verwante Nederlandse organisaties zoals Bont voor Dieren, Vereniging Proefdiervrij. De vereniging subsidieert uit haar middelen ook vele kleinere, vaak meer lokale dierenbeschermingsactiviteiten, zoals opvangcentra.